在生命科技領(lǐng)域，基因編輯工具CRISPR-Cas系統(tǒng)已為人熟知，被稱為“基因魔剪”，能夠靶向特定基因進(jìn)行DNA/RNA序列修改。當(dāng)前，在美國已經(jīng)有多家基因編輯工具公司上市，而技術(shù)底層IP主要被歐美企業(yè)壟斷，原則上使用CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因治療、基因檢測企業(yè)，都需獲得相關(guān)海外企業(yè)的授權(quán)。

據(jù)了解，在商業(yè)化過程中，藥企獲得基因編輯相關(guān)專利許可，需支付數(shù)百到數(shù)千萬美元的首付款，后續(xù)的里程碑付費(fèi)合計(jì)可能高達(dá)上億元。2021年10月，美國干細(xì)胞治療公司Sana Biotechnology與華裔教授劉如謙、張鋒等創(chuàng)建的基因編輯公司Beam Therapeutics達(dá)成合作，Sana向Beam支付5000萬美元預(yù)付款，以獲得CRISPR-Cas12b核酸酶系統(tǒng)的非獨(dú)家商業(yè)權(quán)利。

中國藥企在產(chǎn)品商業(yè)化、特別在國際市場的銷售過程中，也需向海外基因編輯工具企業(yè)支付相應(yīng)的專利許可費(fèi)。因此，這一領(lǐng)域核心技術(shù)的自主可控，研發(fā)更安全、有效的基因編輯工具，成為中國科學(xué)家發(fā)力的方向之一。

輝大基因創(chuàng)始人楊輝博士（國內(nèi)知名科研機(jī)構(gòu)神經(jīng)所高級研究員），2013年起即開始使用CRISPR-Cas工具研究基因編輯動物，回國之后的近10年間，團(tuán)隊(duì)聚焦在基因編輯工具開發(fā)和基因治療。2018年，楊輝博士、姚璇博士等創(chuàng)建了輝大基因，2019年團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了Cas13蛋白的兩個(gè)家族Cas13X、Cas13Y，是繼Cas13a/b/d之后新的RNA編輯工具。

2022年1月，輝大基因CRISPR-Cas13X、Cas13Y的底層技術(shù)獲美國專利局授予專利；并與國內(nèi)某細(xì)胞治療企業(yè)達(dá)成首次“對外普通技術(shù)許可協(xié)議”；5月輝大基因完成數(shù)億元C輪融資。36氪專訪了輝大基因聯(lián)合創(chuàng)始人、CEO姚璇博士，講述公司基因編輯工具的特點(diǎn)，及基因治療藥物管線研發(fā)的新進(jìn)展。

研發(fā)基因編輯工具，成為“桌面上的玩家”

“過去10年間，我們團(tuán)隊(duì)基本把CRISPR-Cas所有的亞族、亞型以及優(yōu)化方法都進(jìn)行了嘗試；在這基礎(chǔ)上，建立了系統(tǒng)的方法論，包括如何發(fā)現(xiàn)新的CRISPR-Cas蛋白，如何針對脫靶、編輯效率、PAM（原型間隔區(qū)相鄰基序）識別等進(jìn)行改進(jìn)，中間積累了很多know-how的細(xì)節(jié)。”姚璇博士總結(jié)道，在后期驗(yàn)證過程中，團(tuán)隊(duì)也開發(fā)了一套檢測系統(tǒng)，以在眾多Cas中定位高活性編輯蛋白。

那么，相比于同類RNA編輯工具，CRISPR-Cas13X、Y有哪些特性？

“Cas13X是目前最小的Cas13蛋白；在編輯效率上，Cas13X/Y在體外試驗(yàn)的敲減活性接近100%，體內(nèi)的編輯效率約95%。除了可以做RNA的knock down，還可以通過對Cas13X/Y進(jìn)行改造、與脫氨酶結(jié)合進(jìn)而實(shí)現(xiàn)RNA單堿基編輯，比如在杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）的基因治療中，目前輝大的單堿基編輯工具基本可實(shí)現(xiàn)接近80%的RNA單堿基編輯效率。”

另外，由于Cas13蛋白普遍存在旁切活性問題，也就是基因編輯中的“脫靶效應(yīng)”，已有研究證明Cas13d可能造成體外細(xì)胞凋亡、Cas13d轉(zhuǎn)基因小鼠存活率顯著降低。針對這一問題，輝大研發(fā)團(tuán)隊(duì)對Cas13d及自研的Cas13X.1進(jìn)行改造，全轉(zhuǎn)錄RNA測序、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、以及轉(zhuǎn)基因小鼠觀察等試驗(yàn)結(jié)果顯示，改造后的高保真版Cas13d以及Cas13X.1，基本檢測不到旁切活性，且在細(xì)胞和動物中顯示出高安全性。

 

æCas13X/Y解析圖

除了RNA編輯工具，輝大集團(tuán)子品牌“HuiEdit”開發(fā)了DNA編輯器Cas12Max，與多個(gè)DNA編輯器相比，Cas12Max蛋白體積更小，適用于基于AAV（腺相關(guān)病毒）載體遞送的體內(nèi)基因編輯。

“將Cas9系統(tǒng)應(yīng)用在體內(nèi)基因治療，可能需要兩個(gè)AAV載體進(jìn)行遞送。Cas12Max體積跟SaCas9相當(dāng)，比spCas9小1kb（Kilobase，即千堿基），只需要一個(gè)AAV載體包裝即可，這對于CMC生產(chǎn)工藝、AAV遞送以及體內(nèi)基因治療的應(yīng)用都有優(yōu)勢，”姚璇博士對36氪表示。

Cas12Max系統(tǒng)，當(dāng)前已經(jīng)應(yīng)用到體內(nèi)基因治療的研發(fā)中，包括肝臟、神經(jīng)和肌肉領(lǐng)域在內(nèi)的多種適應(yīng)癥。在未來的商業(yè)規(guī)劃中，一方面公司會向細(xì)胞治療、植物育種等企業(yè)License-out基因編輯工具；同時(shí)自研基因治療管線，在進(jìn)入臨床二三期或商業(yè)化進(jìn)程中，也將與跨國藥企合作共同開發(fā)。

兩個(gè)基因治療管線將IND

目前輝大基因的研發(fā)管線，主要集中在神經(jīng)、眼科、肌肉、聽力四類，其中眼科的兩個(gè)基因治療管線已經(jīng)進(jìn)入IND申報(bào)階段，針對適應(yīng)癥分別是先天性黑蒙癥2型（LCA2）、老年濕性黃斑病變（wet AMD）。

在基因治療的管線選擇上，藥企多從罕見病著手，一方面是由于超過80%的罕見病是單基因遺傳病，基因治療可糾正潛在遺傳缺陷，是一種有效的治療手段；另外當(dāng)前不少致死、致殘的罕見病，臨床上缺少治療藥物，在這種情況下，患者、監(jiān)管等層面都更有動力嘗試如基因治療這類全新的療法。

先天性黑蒙癥是一種罕見遺傳性視網(wǎng)膜病變，會導(dǎo)致嬰幼兒先天性視盲，在中國有數(shù)千名患者。目前，能夠治療該疾病的藥物僅有AAV遞送RPE65基因的基因治療藥物L(fēng)uxturna，但其售賣價(jià)格高達(dá)42萬美元/針，是普通家庭難以承受的“天價(jià)”。為了改變這一現(xiàn)狀，輝大基因等同類公司在加速研發(fā)LCA的基因療法。

據(jù)姚璇博士介紹，輝大基因的LCA2管線預(yù)計(jì)今年底提交IND，在體內(nèi)試驗(yàn)的安全性和有效性上，“我們采用了一種新的AAV血清型遞送RPE65基因，在動物體內(nèi)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，其使用劑量是現(xiàn)有療法的1/100-1/10，可在動物模型中達(dá)到相似的治療效果。”

低劑量，一方面意味著CMC的壓力會降低，無需大規(guī)模就可生產(chǎn)出足夠的樣品進(jìn)行研發(fā)，以降低藥品生產(chǎn)成本；另一方面也更利于患者的安全。

輝大基因針對老年濕性黃斑變性（wet AMD）的基因治療管線，是通過高保真版Cas13X靶向基因VEGFA，降低VEGFA的表達(dá)量，目前正在研發(fā)過程中，預(yù)計(jì)2023年初提交IND；該療法已在動物試驗(yàn)中積累了近一年的安全性和有效性數(shù)據(jù)。

據(jù)了解，目前治療老年濕性黃斑變性的單抗藥物，約需每4-6周給藥一次，存在用藥依從性問題，給藥過多也可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫落等風(fēng)險(xiǎn)。目前，在非人靈長類實(shí)驗(yàn)中，輝大基因AAV遞送藥物的有效性可維持近一年，有望解決重復(fù)給藥的問題。

此外，輝大基因在研管線還包括神經(jīng)領(lǐng)域的罕見病：AS（天使綜合征）、ALS（萎縮側(cè)索硬化癥，俗稱漸凍癥）、以及肌肉領(lǐng)域的杜氏肌營養(yǎng)不良癥，聽力障礙類疾病。

輝大基因在研管線示意圖，企業(yè)供圖

基因治療的技術(shù)平臺和團(tuán)隊(duì)

開發(fā)新藥的鏈條中，從研發(fā)到放大生產(chǎn)工藝，涉及到多項(xiàng)技術(shù)突破。姚璇博士將輝大基因的技術(shù)平臺歸納為：動物模型、基因編輯、遞送系統(tǒng)、CMC（化學(xué)成分生產(chǎn)與控制）；除了上述在基因編輯底層技術(shù)能力外，他也介紹了輝大在其它三個(gè)技術(shù)平臺上的積累。

針對不同適應(yīng)癥研發(fā)新藥時(shí)，首先要構(gòu)建相應(yīng)的動物疾病模型，用以在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證藥物的安全性和有效性。“楊輝教授在2013年時(shí)，就開始用CRISPR技術(shù)構(gòu)建基因編輯動物，包括嚙齒類小鼠以及非人靈長類猴子等。在此基礎(chǔ)上，輝大在不同疾病領(lǐng)域構(gòu)建多種動物模型用于管線研發(fā)。”

基因治療研發(fā)過程中，“遞送系統(tǒng)”是繞不過去的技術(shù)難點(diǎn)，當(dāng)前輝大基因主要采用AAV病毒載體進(jìn)行體內(nèi)遞送，針對不同類型疾病，開發(fā)高安全性、低免疫原性、高組織特異性的AAV載體。

在生產(chǎn)方面，其搭建了質(zhì)粒工藝平臺、AAV工藝平臺以及分析檢測平臺，初步完成了50L懸浮培養(yǎng)的工藝摸索以及數(shù)十種分析方法的建立；通過不斷優(yōu)化，將促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量符合需求，質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)了解，公司主要精力在底層工具創(chuàng)新和管線開發(fā)，因此藥物進(jìn)入IND環(huán)節(jié)后，輝大基因也將與業(yè)內(nèi)CDMO公司合作生產(chǎn)。

在生物醫(yī)藥行業(yè)融資遇冷，資本市場趨于理性的行情下，輝大基因于2022年5月完成數(shù)億元C輪融資。為什么能夠獲得機(jī)構(gòu)持續(xù)的投資，對此姚璇博士認(rèn)為，核心在于輝大基因在CGT領(lǐng)域的差異化，基因編輯工具之于CGT行業(yè)，如同汽車的發(fā)動機(jī)、芯片的技術(shù)。“現(xiàn)階段公司在底層工具和管線研發(fā)技術(shù)上，具備競爭力；同時(shí)也在完善CMC工藝開發(fā)、臨床研究等團(tuán)隊(duì)，豐富研發(fā)管線布局，改進(jìn)新技術(shù)平臺、新遞送系統(tǒng)。”

姚璇博士表示，未來3-5年中國基因編輯、基因治療領(lǐng)域應(yīng)該會有持續(xù)突破和發(fā)展。輝大基因正開放基因編輯工具能力，希望能和更多生物創(chuàng)新藥企、基因檢測公司及各領(lǐng)域?qū)＜医⒑献鳎餐瑢⒅袊袌隹臻g做大。